系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種典型的自身免疫性疾病，以免疫系統(tǒng)異常激活為特征，具有高度的細(xì)胞異質(zhì)性，可導(dǎo)致多個器官和組織的慢性炎癥和衰弱損害。SLE在臨床上的發(fā)展、表征和嚴(yán)重程度具有較大差異性，病程難以預(yù)測。因此，準(zhǔn)確識別SLE發(fā)病的遺傳學(xué)和細(xì)胞型特異性機(jī)制，將有助于改善SLE的治療。先前的研究發(fā)現(xiàn)CD8⁺T細(xì)胞參與了SLE的發(fā)病過程，但是CD8⁺T細(xì)胞在SLE中的細(xì)胞異質(zhì)性及其機(jī)制尚不清楚。

2023年3月，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院郭慶課題組和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳坤研究組等單位合作在eBioMedicine上發(fā)表了“Cytotoxic CD161^?CD8⁺ T_EMRA cells contribute to the pathogenesis of systemic lupus erythematosus"的文章。該研究揭示了SLE的細(xì)胞異質(zhì)性，證實(shí)了DTHD1相關(guān)的CD161^?CD8⁺ T_EMRA細(xì)胞亞群在SLE的發(fā)病機(jī)制中的重要作用，為SLE的診斷和治療提供了一個新的視角。

為研究與SLE細(xì)胞類型特異性改變相關(guān)的遺傳關(guān)聯(lián)，研究人員對一個SLE家系的外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）和全外顯子組測序（WES），以探究與SLE相關(guān)的免疫細(xì)胞組成的變化。結(jié)果表明，scRNA-seq和WES數(shù)據(jù)不僅呈現(xiàn)了SLE中已知的B細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞異質(zhì)性，還發(fā)現(xiàn)PBMCs中的CD8⁺T淋巴細(xì)胞同樣具有明顯的異質(zhì)性。

接下來，研究人員利用Monocle3揭示了CD8+T細(xì)胞從初級CD8_SELL細(xì)胞開始，通過以CD8_GZMK細(xì)胞為特征的中間狀態(tài)，最終到達(dá)兩個獨(dú)立的終端譜系（終末分化T細(xì)胞，T_EMRA），分別是CD8_GZMB和CD8_GZMH。基因差異表達(dá)（DEG）分析表明，CD8_GZMB細(xì)胞高表達(dá)“T細(xì)胞活化"、“T細(xì)胞受體信號通路"相關(guān)基因，而CD8_GZMH細(xì)胞則高表達(dá)CD161、KLRC2、IKZF2和LAG3等NK細(xì)胞特征基因。此外，CD8_GZMB細(xì)胞表現(xiàn)出比CD8_GZMH細(xì)胞更低的耗竭分?jǐn)?shù)和更高的激活分?jǐn)?shù)，表明它們在SLE發(fā)病機(jī)制中的不同作用。因此，研究人員將CD8_GZMB細(xì)胞和CD8_GZMH細(xì)胞分別更名為CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞和CD161⁺CD8⁺T_EMRA細(xì)胞。有趣的是，細(xì)胞毒性CD161^?CD8⁺ T_EMRA細(xì)胞在SLE患者中顯著增加，并且該亞群的激活與病毒感染密切相關(guān)。通過對來自具有SLEDAI評分的SLE患者公開的RNA-seq圖譜分析，研究人員證明了CD161的低表達(dá)與高SLEDAI評分密切相關(guān)，CD161^?CD8⁺T_EMRA更能代表SLE的病理特征。

隨后，WES分析發(fā)現(xiàn)，在SLE家系中與SLE高度相關(guān)的DTHD1基因的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）存在移碼突變，在SLE患者的PBMCs中的表達(dá)顯著下調(diào)，并在CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞呈現(xiàn)低表達(dá)。為探究DTHD1下調(diào)如何影響CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞在SLE中的異常增殖，研究人員從健康人PBMCs分離出CD8⁺T細(xì)胞，對DTHD1進(jìn)行基因敲降，顯著促進(jìn)了包括p38 MAPK通路和mTOR通路在內(nèi)的細(xì)胞增殖信號的激活，提示DTHD1的下調(diào)可能有利于細(xì)胞的增殖和抗凋亡（圖1j、k）。隨后，通過將CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞與P815共培養(yǎng)，證實(shí)了DTHD1基因沉默的人原代CD8+T細(xì)胞對P815細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力。

圖1 DTHD1敲降實(shí)驗(yàn)

作者進(jìn)一步研究了DTHD1在SLE發(fā)病中的的分子機(jī)制。相互作用分析表明，DTHD1可以通過DD與髓樣分化因子（MYD88）相互作用，NF-κB是MYD88誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的核心轉(zhuǎn)鐵蛋白（圖2e）。實(shí)驗(yàn)證明，野生型DTHD1而不是突變體DTHD1的過表達(dá)顯著降低了MYD88誘導(dǎo)的NF-κB的激活（圖2h）。因此，DTHD1的低表達(dá)或失活將釋放其對MYD88的抑制，激活NF-κB信號。此外，mTOR信號激活是T細(xì)胞增殖的主要原因，使用化學(xué)抑制劑TAK-242可以抑制MYD88活性，阻礙TCR誘導(dǎo)的mTOR信號的激活，進(jìn)而抑制CD8⁺ T_EMRA細(xì)胞擴(kuò)增，并有效降低對P815細(xì)胞的細(xì)胞毒性（圖2i）。上述結(jié)果表明，DTHD1基因突變可通過調(diào)節(jié)MYD88介導(dǎo)的途徑導(dǎo)致細(xì)胞毒性CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞亞群的異常擴(kuò)增，是SLE發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。同時，作者發(fā)現(xiàn)CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞可以通過光信號與其他免疫細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致全身性炎癥。在SLE的臨床診斷中，該細(xì)胞亞群也可以作為一種新的細(xì)胞標(biāo)志物。

值得注意的是，鑒于原代T細(xì)胞難轉(zhuǎn)染的特性，為了研究DTHD1基因在CD8⁺ T細(xì)胞中的功能，研究人員在上述實(shí)驗(yàn)中借助了NEPA GENE品牌的NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)進(jìn)行基因過表達(dá)和敲降，成功將3μg WT/Mutant-DTHD1過表達(dá)質(zhì)粒和50 nM DTHD1 siRNA/NC siRNA分別電穿孔到5×10⁶人原代CD8⁺ T細(xì)胞中，為實(shí)驗(yàn)的成功提供了重要助力。

圖2 DTHD1基因突變增強(qiáng)CD161^?CD8⁺T_EMRA細(xì)胞毒性