新開發(fā)的療法，如干細胞療法，正在將醫(yī)學領域從治療癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹斡膊?。人類誘導多能干細胞(iPSCs)以其分化為不同細胞類型和組織的能力改變了再生醫(yī)學。雖然人類iPSCs已經(jīng)用于自體治療，但下一個突破將是開發(fā)經(jīng)認證的iPSCs用于現(xiàn)成的治療。為了實現(xiàn)這一目標，可以通過人類白細胞抗原(HLA)消耗來降低異種iPSCs的免疫原性，從而建立GMP級的主細胞庫，用于細胞的大規(guī)模生產(chǎn)，同時降低同種異體療法的制造成本[1]。
開發(fā)基因工程的iPSCs需要在轉(zhuǎn)染后進行幾輪克隆篩選，傳統(tǒng)的有限稀釋法分離單細胞耗時長，熒光標記分選影響高度敏感的iPSCs的存活率，并且有污染的風險。相比之下，CYTENA的克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)利用透明微流控芯片和實時成像技術、算法，以高活力和高效率將單細胞分選和分配到96/384孔板內(nèi)。
近年來，利用此設備分離iPSCs的方法已被報道[2-4]。在這里，展示了使用UP.SIGHT在不損失多能性的情況下，對人類iPSCs溫和分離單細胞克隆在技術上是可行的，在方法優(yōu)化后的單克隆回收率高達80%。
材料與方法
來源于人成纖維細胞的對照iPSCs在無滋養(yǎng)層細胞的6孔板中，用TeSR E8培養(yǎng)基培養(yǎng)[5]。細胞匯合度到70%的時候，按1:3 ~ 1:6比例稀釋傳代。用于單細胞分選的細胞也在60- 70%的匯合度下進行收獲，確保細胞看起來健康且未分化的狀態(tài),并以0.5-0.8x10 6個細胞/ mL的濃度在基礎培養(yǎng)基中重懸為單細胞懸液。將80 uL的單細胞懸液裝入芯片(EASY.ON cartridge)并安裝在UP.SIGHT上進行單細胞分選。單細胞重懸液和孔板中的克隆培養(yǎng)基中都含有ROCK抑制劑，單細胞分選于裝有克隆培養(yǎng)基的96孔板上，分選完的板子盡快轉(zhuǎn)回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在前7天用UP.SIGHT監(jiān)測iPSCs的單克隆生長。
結(jié)果與討論
對照組采用手動有限制稀釋法，濃度為0.5個細胞/孔進行鋪板 [6-7]，10天后達到了預期的10-20%的克隆率(數(shù)據(jù)未顯示)。使用UP.SIGHT進行的第一次分選實驗在相同的條件下獲得了6%的克隆率(圖1 A)。以這些實驗設計為基準，通過系統(tǒng)的逐步優(yōu)化條件來逐漸提高回收率。
首先，我們優(yōu)化了裝載在UP.SIGHT墨盒上的細胞重懸液。確定與使用原始基礎培養(yǎng)基相比，使用鹽水緩沖液后近乎使克隆恢復提高一倍(圖1 B)。其次，由于iPSCs通常需要定期更換培養(yǎng)基，這種在早期更換培養(yǎng)基的操作對脆弱敏感的iPSCs的生長是有不利的，我們測試了在分選后的前7天中通過添加補充制劑到培養(yǎng)基中來避免更換培養(yǎng)基組份的效果。用補充制劑A(圖1 C)和不同濃度的補充制劑B(圖1 D和E)添加到克隆培養(yǎng)基，均可以獲得更高的單克隆率，其中補充制劑B可提高到50%。
圖1：優(yōu)化分選提高克隆回收率
A:初始重懸細胞液條件，與標準培養(yǎng)條件最相似。B:鹽溶液作為重懸液。C:添加了補充制劑A的克隆培養(yǎng)基. D-E:添了不同濃度補充制劑B的克隆培養(yǎng)基. F:克隆培養(yǎng)基改為添加了補充制劑B的單細胞克隆培養(yǎng)基?？寺』謴椭狄缘?-10天克隆生長孔的百分比表示。
添加劑能夠保持分選后的培養(yǎng)板細胞在前7天不受干擾，顯著提高了克隆率。在7天后，我們獲得了更大尺寸和良好形態(tài)的克隆團(圖2)。最后，我們替換了克隆板中的標準培養(yǎng)基，并使用優(yōu)化的培養(yǎng)基進行iPSCs的單細胞接種，優(yōu)化條件包括鹽溶液重懸樣品，加上適合目的的克隆培養(yǎng)基，并以優(yōu)化濃度的培養(yǎng)基補充物等，從而獲得高達80%的單克隆率(圖1 F)和長勢良好的克隆團(圖2)。
(值得一提的是：此次實驗還測試了其他沒有顯著影響克隆恢復的參數(shù)。如，不同的ROCK抑制劑配方、板涂層和板類型。但不能認為這些變量在其他實驗條件下使用時不會對克隆恢復產(chǎn)生影響。)
圖2：克隆生長與形態(tài)
使用UP.SIGHT分選單細胞到96孔板中，并在第7天進行板底成像。
本實驗中對UP.SIGHT板成像能力也進行了測試。從圖中能夠確認圖像質(zhì)量足夠好，可以評估克隆的形態(tài)，以確定細胞在單細胞分選后是否保持其典型的iPSCs形態(tài)(圖2)。
圖3：用UP.SIGHT進行克隆生長監(jiān)測
此外，UP.SIGHT上的成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)顯微鏡相比具有更快的優(yōu)勢:整個孔板(96/384孔板)的圖像采集不到6分鐘，大大減少了孔板在培養(yǎng)箱外的停留時間，尤其是384孔板。當在全孔板上進行初始篩選時，這一點特別重要，可以在多個時間點快速進行成像(圖3)。
結(jié)論
本研究表明，使用UP.SIGHT分選iPSCs可獲得良好形態(tài)的克隆團，具有較高的克隆恢復率。為了更大化克隆恢復，可通過優(yōu)化關鍵參數(shù)：細胞在分選前收獲時的活率和生長狀態(tài)、細胞懸液、克隆培養(yǎng)基及補充物，以確保細胞在分選后的第一天盡可能不受干擾；UP.SIGHT的快速平板成像功能可實現(xiàn)生長克隆的形態(tài)監(jiān)控和快速篩選。
總之，UP.SIGHT是一種多用途儀器，可實現(xiàn)高效、高質(zhì)量和節(jié)省時間的iPSCs分選和早期監(jiān)測，以選擇正確優(yōu)質(zhì)的單克隆。
參考文獻
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