前言
早在1976年，德國(guó)科學(xué)家Frieden Stein和他的同事在骨髓中發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，后來的研究者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化成不同類型的細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，而且沒有醫(yī)學(xué)倫理的困擾，所以受到科學(xué)家的青睞，被廣泛應(yīng)用于組織再生、器官修復(fù)、血液病、癌癥治療等領(lǐng)域。
MSC的體外培養(yǎng)擴(kuò)增不可避免地經(jīng)歷復(fù)制性衰老，伴隨著基因組不穩(wěn)定性，這是MSC細(xì)胞治療行業(yè)一個(gè)嚴(yán)重的障礙。此外，因?yàn)榻臃N起始MSC細(xì)胞濃度不一樣，即使經(jīng)過相同的擴(kuò)增代數(shù)，細(xì)胞的復(fù)制周期是不一致的，導(dǎo)致批次間生產(chǎn)的MSC細(xì)胞的穩(wěn)定性差，這也是目前MSC細(xì)胞在治療行業(yè)的一個(gè)瓶頸。 因此通過單一MSC細(xì)胞來源的穩(wěn)定細(xì)胞株為提供可持續(xù)的、穩(wěn)定的MSC細(xì)胞生產(chǎn)成為關(guān)鍵，可以助力MSC干細(xì)胞治療行業(yè)的快速發(fā)展。
為什么要挑選MSC細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株？
細(xì)胞單克隆性，一般指用于建立最初的種子庫(kù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞來源。藥物生產(chǎn)過程中，具有單克隆源性的細(xì)胞庫(kù)能夠更好地保持產(chǎn)品批次之間的質(zhì)量一致性，因此在三級(jí)細(xì)胞庫(kù)建立過程中細(xì)胞的來源一致性尤為重要；這一點(diǎn)也是預(yù)防種子庫(kù)細(xì)胞變異的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵，也可更好的對(duì)上游工藝開發(fā)和下游產(chǎn)品質(zhì)量的把控。
相反的，多克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功后不同細(xì)胞克隆生長(zhǎng)速度不一致，目的基因表達(dá)量比較低的細(xì)胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右會(huì)觀察到表達(dá)量逐漸下降，且不能長(zhǎng)期維持細(xì)胞表型。
考慮到產(chǎn)品安全性，F(xiàn)DA的政策和法規(guī)都要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據(jù)，用以證明生產(chǎn)用的細(xì)胞株的單克隆源性。
本文詳細(xì)介紹了利用Cytena公司開發(fā)的單細(xì)胞打印技術(shù)(SCP technology)，通過將單個(gè)的MSC細(xì)胞自動(dòng)分離到標(biāo)準(zhǔn)的96/384孔板中，大大加速M(fèi)SC單克隆細(xì)胞株的開發(fā)。
材料與方法
1、細(xì)胞類型：貼壁的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)。
2、樣品處理方法：
1) 用胰酶消化處理MSC細(xì)胞，變成懸浮細(xì)胞；
2) 用biosharp DMEM低糖培養(yǎng)基清洗重懸細(xì)胞，用40 μm的篩網(wǎng)過濾樣品，去除細(xì)胞團(tuán)塊；
3) 按照7E5cells/ml的密度，將細(xì)胞加入一次性的分選芯片中。
3、分選工具：德國(guó)Cytena單細(xì)胞打印機(jī)F.SIGHT 2.0和一次性Catridge
圖1：克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)分選流程圖
(single-cell printer™，scp™)
結(jié)果
表1是通過SCPTM和手動(dòng)-LD方法分選的多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)SCPTM分選的D0單細(xì)胞率是手動(dòng)-LD的4倍，在培養(yǎng)15天后統(tǒng)計(jì)“單克隆率”發(fā)現(xiàn)是手動(dòng)-LD的3.67倍之多(表2)！
表1：MSC細(xì)胞單細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)表
由于MSC細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，細(xì)胞的結(jié)團(tuán)率比較高，所以MSC的單細(xì)胞率不像懸浮類細(xì)胞的高(CHO單細(xì)胞率可以達(dá)95%以上)，但是相比于平行的有限稀釋法來說，單細(xì)胞率也提高了近4倍，提高了單克隆的篩選效率。
表2：MSC細(xì)胞單克隆率統(tǒng)計(jì)表
采用一次性的微流控芯片進(jìn)行單細(xì)胞分選，每次只產(chǎn)生約150pL的液滴，單細(xì)胞率高。無菌的一次性的芯片可以避免項(xiàng)目之間的交叉污染，設(shè)備無需清洗和驗(yàn)證，有利于日后項(xiàng)目的申報(bào)審批。
圖2：微流控Cartridge芯片(150pL/單液滴體積)
討論
單細(xì)胞率是決定單克隆率高低的關(guān)鍵性因素，因此為尋求最適MSC貼壁樣品篩選條件，我們做了以下測(cè)試：
板A1-3篩選圓度范圍為0.5-1，板A4縮小圓度范圍為0.7-1，直徑范圍均為15-25μm。
表1中“手工-LD”部分結(jié)果包括多克隆團(tuán)，因此表2中 LD方法“D15單克隆率 < 20%”。
Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)(single-cell printer™，scp™)采用的芯片，能溫和、高效、快速的分選，既保證了D0高的單細(xì)胞率，又結(jié)合了高分辨率的光學(xué)系統(tǒng)，留下單細(xì)胞分選的“印跡”，通過設(shè)置細(xì)胞的直徑、細(xì)胞圓度、細(xì)胞熒光強(qiáng)度等質(zhì)控方式，分選出“強(qiáng)壯”的細(xì)胞，利于后期克隆恢復(fù)，獲得高的單克隆率。
結(jié)論
SCPTM所獲得貼壁的MSC單克隆率是手工-LD的3.67倍多！分選條件設(shè)置為：圓度范圍在0.5-1，直徑范圍在15-25μm，更適合于MSC樣品的單細(xì)胞篩選！這也說明了SCPTM可以很好的應(yīng)用于MSC單克隆細(xì)胞株的篩選，助力于MSC細(xì)胞在細(xì)胞治療、基因治療、組織工程以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展！
關(guān)于艾貝泰
廣州市艾貝泰生物科技有限公司立足于生物工藝的優(yōu)化、放大及生產(chǎn)，除了為國(guó)內(nèi)客戶提供高品質(zhì)的Applikon生物反應(yīng)器，還引進(jìn)了先進(jìn)的產(chǎn)品，如Nova生化分析儀、Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印機(jī)系統(tǒng)、Kaiser拉曼在線生物工藝分析儀、Flownamics在線取樣器、Constant Systems高壓細(xì)胞破碎儀等。為滿足生物制藥行業(yè)高速發(fā)展的需要，艾貝泰也專業(yè)研發(fā)和生產(chǎn)一次性使用的生物工藝設(shè)備和耗材。艾貝泰不斷完善生物制藥領(lǐng)域的產(chǎn)品線，為用戶提供多方位的專業(yè)產(chǎn)品解決方案。
